August – December 2008 Entries

23 Agosto 2008.

¡Hola!

Luego de un verano maravilloso, es momento de regresar a nuestras labores como investigadores. Pero antes quisiera contarles sobre las actividades que realicé durante el verano y cuales son mis planes para este segundo semestre participando del programa BioMinds.

* Activivades investigativas del verano*

Durante este verano tuve la oportunidad de irme de internado a Tufts University School of Medicine en Boston, MA. Allí trabaje junto al Dr. Theoharis Theoharides en el Departamento de Farmacología. Mi proyecto de investigación se tituló “Effect of Estrogen on Mast Cell Activation”. Para resumirles brevemente mi trabajo, tuvimos como fin el análisis del efecto de estrogeno en la activación de “mast cells” basados en la interrogante presentada en la literatura en la cual enfermedades como fibromialgia, cistitis intersticial, y el síndrome de fatiga crónica tienen una mayor prevalencia en feminas que en el género masculino. Además procesos de alergia e inflamación se agravan en las feminas durante la pubertad. Se asocia al estrogeno con estos procesos de inflamación y alergias, ya que las “mast cells” presentan receptores a este. Nuestra hipotésis se centraba en que el estrogeno causaria una mayor degranulación (liberación del contenido de los granos que se encuentran en el interior de las células). La metodologia consistió en cultivar células humanas obtenidas del cordón umbilical para luego estimular la degranulación (utilizando Substance P), y a la vez se estimilaban con beta-estradiol (estrogeno) en una concentración fisiológica. Para medir el nivel de degranulación se midió la cantidad de IL-8 liberado utilizando la prueba ELISA. Los datos se compararon con la liberación espontanea y con alfa-estradiol (+ control). Al finalizar los experimentos, llegamos a la conclusión de que la sustancia P si estimula las cálulas a la degranulación, pero estrógeno no aumenta su efecto. El grupo de trabajo en el laboratorio del Dr. Theoharides continuará trabajando con este experimento, ya que se considera que se debe repetir varias veces realizando unos cambios en la metodología, relacionados con el tiempo de estimulación y las concentraciones utilizadas para así llegar a conclusiones. Si les interesa en conocer más sobre este trabajo o tienen alguna duda pueden comunicarse conmigo.

* Propuesta de Investigación para este Semestre:*

A- Metas por alcanzar:

Durante este semestre y luego de finalizar el análisis bioinformático de metalloprotainasas estaré realizando los siguientes experimentos:

1)PCR- para amplificar las regiones conservadas en metalloproteinasa.

2)Se medirá la actividad enzimática de las metalloprotainasas utilizando el fluorometro.

3)Zymogram: (Gel de poliacrilamida) para medir el peso molecular y determinar el tamaño de las enzimas.

En el transcurso del semestre pueden haber modificaciones en nuestros objetivos dependiendo de cómo se vaya desarollando el proyecto.

* ¿Cómo este semestre se relaciona con el trabajo realizado en el semestre anterior?

El trabajo que estaremos realizando este semestre está completamente enlazado a nuestro semestre anterior. Continuamos trabajando con el análisis de metalloproteinasas aunque dejando a un lado la bionformática y entrando en el análisis de la actividad enzimática y la función de las mismas.

*¿Qué nuevas técnicas planeas desarrollar?

A diferencia del semestre pasado, en este semestre estaré realizando experimentos dentro del laboratorio . Hasta el momento se que estaré trabajando con PCR, flourometro, y la gel de poliacrilamida. Tan pronto se sigan añadiendo nuevas técnicas se las dejaré saber y les contaré sobre mi experiencia utilizando las mismas.

Gracias por visitar mi blog, espero que los haya puesto al tanto de todo lo que esta ocurriendo con mi proyecto de investigación y hacia dónde nos dirigimos. Cualquier duda o comentario me dejan saber.

25 septiembre 2008.

*Técnica de laboratorio aprendida*

La técnica que he realizado es Polymerase Chain Reaction (PCR). Esta técnica sirve para amplificar piezas de DNA mediante replicación enzimática. He estado amplificando las regiones conservadas halladas en las secuencias de metaloproteinasas (colagenasa y gelatinasa) en Rhesus.

*Progreso: En este momento mi investigación tiene un progreso de 2, ya que éste es el primer objetivo que realizamos de los tres que nos habiamos propuesto para este semestre. Aunque también he estado trabajado en la propuesta de mi trabajo, la cual será presentada este sábado 27 de septiembre.

*Durante el principio de este semestre tuvimos un poco de dificultad, ya que mi mentor tuvo que estar unos dias fuera por motivos personales por lo que el trabajo ha tenido poco progreso. Pero ya esta situación está resuelta, y estamos encaminados a cumplir con todos los objetivos propuestos.

21 octubre 2008.

Durante este mes hemos logrado que el trabajo de investigación progrese, y nos encaminamos a cumplir con los objetivos propuestos para este semestre. Basicamente hemos estado realizando PCR para amplificar los primers que se habían diseñado durante el semestre anterior, además hemos trabajadon con electroforesis para analizar los productos amplificados. Los resultados obtenidos no han sido los mejores, pero estamos trabajando en la optimización de la téctina para encontrar la solución al problema. Además, estamos trabajando con la preparación del próximo experimento que realizaremos, el cual será para detectar la actividad enzimática de las metalloproteasas. A juzgar por el trabajo ya realizado y por el que nos falta por realizar puedo decir que mi trabajo se encuentra en un progreso de 3, pero estamos trabajando muy fuerte para lograr cumplir con todos nuestros objetivos al final de este semestre.

*Contribución científica de mi experimento:

La importancia de este trabajo reside en la relevancia del mismo para obtener nueva información que nos puede ayudar a explicar como MMP-1 (colagenasa) y MMP-2 (gelatinasa) trabajan, cómo son controladas y cómo influeyen en la biología. Colagenasa y gelatinasa son de suma importancia en la regulación de la conducta celular. Los genes que codifican para las mismas juegan un papel importante en varios procesos biológicos y padecimientos ( principalmente de la visión), pero todavía los mecanismos que muestran sus influencias están mayormente sin resolverse. Además, el análisis molecular y funcional de estas metaloproreasas nos puede brindar información sobre cómo podemos regular la función normal de estos genes, la cual puede desarrollar nuevas formas para prevenir o tratar enfermedades , especialmente oculares.

18 de noviembre de 2008.

Hola!

Durante este semestre se han presentado algunas dificultades en el progreso de mi proyecto, pero se han ido resolviendo y continúo trabajando arduamente junto a mi mentor para obtener los mejores resultados posibles.  Nos  hemos enfocado en el análisis  de la funció de MMP-1 y MMP-2. Continuando con el trabajo realizado durante el semestre anterior hemos utilizado los primers ya diseñados para realizar la amplificació de los mismos. Para dicha amplificación hemos utilizado la técnica conocida como PCR. Esta técnica se ha realizado combinando primers o utilizando el mismo primer (como up y down). El propósito de esta técnica es amplificar las regiones conservadas para posteriormente realizar la caracterización de MMP-1 y MMP-2. Luego de amplificar las regiones hemos preparado geles de agarosa en las cuales se corre el producto amplificado para determinar el tamaño del mismo. Hemos presentado algunas dificultades con las geles, ya que en la mayoría de los experimentos no se ha identificado ninguna banda. Continuamos repitiendo los experimentos y modificando el protocolo utilizado para lograr realizar el experimento correctamente.

Por otro lado, estamos planificando la realización de experimentos mediante una reacción enzimática (utilizando “Protease Detection KIt”) para determinar la función de MMP-1 y MMP-2. Durante esta semana estaremos trabajando en los experimentos control para conocer las condiciones optimas de tiempo y las concentraciones correctas de los reactivos para llevar a cabo el experimento. Además, estamos esperando por algunos materiales que se pidieron para trabajar la reacción enzimática con colagenasa y gelatinasa.

Para el próximo semestre estaremos trabajando en el inhibición de la función enzimática de MMP-1 y MMP-2. Además, realizaremos “Gelatin Zymography” para determinar la actividad enzimática de acuerdo al tamaño de las moléculas.