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26 Enero 2009.

Hola a todos!

Durante este semestre estaré trabajando junto a mi mentor arduamente en la parte final de mi proyecto de investigación para BioMinds. Al finalizar este semestre nuestra meta es haber logrado cumplir con los siguientes objetivos:

1. Finalizar los experimentos de optimización para el procedimiento a utilizarse en la detección de la actividad enzimática para colagenasa y gelatinasa.

2. Llevar a cabo los experimentos para determianr la actividad enzimática de colagenasa y gelatinasa.

3. Repetir experimentos de PCR (haciendo cambios en el método) para amplificar las regiones conservadas en colagenasa y gelatinasa basándonos en los resultados obtenidos en el semestre anterior.

4. Llevar a cabo los experimentos de inhibición de función para gelatinasa y colagenasa utilizando el método conocido como SELEX.

Varios de los experimentos que estaremos realizando durante este semestre son continuación del trabajo que realizamos el semestre anterior. Durante el semestre anterior, realizamos experimentos de PCR para la amplificación de las regiones conservadas pero para este semestre repetiremos los experimentos con algunas modificaciones ya que en el semestre anterior no obtuvimos ninguna banda (según PCR electronico, debe haber producto amplificado). Además, el semestre anterior realizamos experimentos de optimización para el procedimiento ha utilizarse en la detección de la actividad enzimática de colagenasa y gelatinasa. Las partes de mi proyecto están entrelazadas o guardan relación entre ellas, por esta razón lo que se hace en un semestre es de suma importancia para los experimentos siguientes.

La técnica que estaremos desarrollando dunrante este semestre será SELEX. Esta técnica será utilizada con para la determinación de la función enzimática y la inhibición de función para colagenasa y gelatinasa. SELEX permite que se monitoreen simultaneamente “pools” de DNA y RNA de moleculas con una caracteristica en particular.

17 Febrero 2009.

Hemos estado trabajando arduamente para poder cumplir con los objetivos propuestos. En estos meses he realizado los siguinetes experimentos:

1. Optimizacion de Kit para la Determinacion de la Actividad Enzimatica de Proteasas (para tiempo y concentracion).

2. Repeticion de PCR de los primers dise~ados previamente, pero con variacion en el protocolo utilizado.

3. Electroforesis de Gel de Agarosa: para visualizar los productos obtenidos en la amplificacion.

Con relacion la progreso del proyecto considero que vamos trabajando a buen ritmo para poder realizar la mayor cantidad de experimentos posibles. Pero hasta este momento puedo decir que nos encontramos en el nivel 2 de progreso. Son muchos los objetivos propuestos, pero trataremos de cumplir con todos los que el tiempo nos permita. Durante este semestre no hemos tenido muchas dificultades, aunque si la falta de algunos materiales que no se habian pedido. Para resolver este inconveniente hemos hecho el pedido correspondiente, pero como ya sabemos cada pedido tarda un tiempo en ser recibido. Esperamos que nuestro proyecto siga progresando para asi poder presentarles este interesante trabajo con los resultados obtenidos el proximo mes de marzo.

* Abstract*

Functional Analysis of Rhesus Macaca mulatta Collagenase (MMP1) and Gelatinase (MMP2) Domains, Important for Eye Development, Vision and Ocular Diseases

A. Maldonado and M. Rubin, Biology Department, University of Puerto Rico at Cayey

Matrix Metalloproteases (MMPs) are extracellular enzymes from a group of proteinases that are characterized by their potent ability to degrade structural proteins of the extracellular matrix. MMPs function in many biological processes and some ocular diseases, but the mechanisms by which MMPs regulate most processes of development, homeostasis, and disease are not fully understood. We undertook this work to study how MMPs are conserved in mammalian and primate evolution, what protein domains can be inhibited to perturb function, and what is the phenotype of cultured cells after inhibition of MMP function.

The molecular analysis consists of bioinformatic experiments to identify the conservation between MMP-1 and MMP-2 sequences. MMP protein sequences were extracted using the NCBI database and ClustalW multiple sequence alignments (EBI) were performed to determine the conserved regions.  From these experiments we concluded that the MMP-1 isoforms in Macaca mulatta are highly conserved. We also analyzed the highly conserved gelatinase (MMP-2) protein sequences. The conserved metal binding (H) and catalytic domain (E) residues characteristic of metalloproteinases were conserved and detected in each alignment. Based on the conserved regions identified in collagenase and gelatinase, we designed primers using the Primer3 Program. These primers detected MMP genes using electronic PCR (ePCR) from NCBI and were used to PCR amplify gene fragments encoding collagenase and gelatinase domains from Rhesus M. mulatta genomic DNA.

The functional analysis of MMPs will be performed by the detection of metalloprotease enzymatic activity and the inhibition of the MMP function using aptamers. Our interest in studying the effects of functional inhibition are based on the fact that inhibition of MMP activity could be a way to develop therapeutic treatments for ocular diseases related to the expression and function of MMPs. Future experiments include the analysis of MMP enzymatic function using the Protease Fluorescent Detection Kit (Sigma Aldrich) and functional inhibition using phosphoramidon and 1,10-phenanthroline as inhibitors of MMP activity.  We will also use the SELEX technique to evolve inhibitory aptamers based on the fact that SELEX allows the simultaneous screening of highly diverse pools of different RNA or DNA molecules for a particular feature, in our case to select the molecules that bind to MMPs and inhibit protease enzymatic activity.

MMP-1 and MMP-2 are important genes that regulate many diverse cell functions and cellular interactions. The molecular and functional analyses of these MMPs will be central to develop new ways to prevent or treat some ocular diseases. The in vivo genetic approaches that test the consequence of selective gains or losses of MMP function are key ways to understand how MMPs promote ocular diseases and how these diseases can be treated.

We thank the UPR-Cayey Biology Department, Honors Program, RISE Program (NIH GM 59429), and the BioMinds Program (funded by the Amgen Foundation) for supporting this research.

22 Abril 2009.

Durante la actividad cumbre del Programa BioMinds tuve la oportunidad de evaluar 3 afiches. Los mismos pertenecian a estudiantes del Recinto Universitario de Mayaguez. Aquí un breve resumen de cada trabajo y mis comentarios sobre los mismos:

1. “Construction of a small size metagenomic library derived from Tabonuco Forest in Puerto Rico” By Amaris Torres

El objetivo principal de este trabajo consistió en generar una libreria mutagenomica de DNA de bajo peso molecular del Bosque Tabonuco en el Yunque. Según explicado por Amaris, ellos extrajeron DNA de muestas de suelo, el DNA fue cortado con endonuceasas para generar tamaños apropiados. Los fragmentos resultantes fueron purificados y clonados en E. coli, los clones positivos fueron confirmados para la presencia de un inserto mediante el analisis de restricción. Luego de escuchar la explicación sobre el proyecto le pregunte a Amaris sobre la importancia del trabajo y la tecnica utilizada para analizar el fragmento clonado. Este afiche contenia todas las partes requeridas, el abstracto permitia tener una idea clara sobre el proyecto y en general contenia toda la informacion necesaria para interesarse en el proyecto.

2. “Characterization of Marine Bacteria Capable of Tolerate and/or Degrade Long Chain and Aromatic Hydrocarbons” by Eva Nelly Rubio

El objetivo de este proyecto era identificar bacterias bioluminiscentes que pudieran tolerar y/o degradar hidrocarburos aromaticos y complejos. Ellos determinaron la mejor concentración inhibitoria minima para los reactivos fenantreno y naftaleno. Luego de determina la concentración antes mencionada, las bacterias fueron inoculadas en Agar Luminiscente . En conclusión determinaron que seis organismos fueron capaces de crecer durante las pruebas de fenantreno. El trabajo tiene como meta a largo plazo desarrollar un biosensor, el cual pueda impactar los campos científicos y biotecnologicos en Puerto Rico y el mundo. A Eva Nelly le pregunté sobre una breve definicion de la palabra bioremedación y sobre si conocia el mecanismo de las bacterias para degradar los compuestos aromaticos de hidrocarburos. En general, puedo decir que este afiche y la presentación del mismo fueron excelentes.

3. “”Water quality in the irrigation system from Lajas Valley: Presence and Quantification of Enterococci and coliform bacteria” By Sheila González

Sheila durante su presentación explicó la importancia de su trabajo partiendo de la idea de que E.coli y Enterococcus son indicadores potenciales de contaminación fecal en los cuerpos de agua. La contamicación fecal de los cuerpos de agua puede afectar la salud de las personas que consumen los productos agricolas irrigados con agua contaminada. Ellos analizaron las presencia de estos organismos en once estaciones en las bahias de Guánica y Boquerón. Concluyeron que cuatros de diez estaciones excedian los numeros estandares para los conteos de las bacterias. Posteriormente ellos realizarian experimentos para confirmar la identidad de estos microorganismos. Además realizarian extracciones de DNA, amplificación y sequenciación. A Sheila le pregunté sobre las tecnicas utilizadas para cuantificar la cantidad de bacteria y las consecuancias para la salud de las personas debido a la contaminacion con dichos organismos. Para mi fue un placer evaluar este afiche ya que Sheila es mi amiga y fue compañera de estudios en la escuela superior. Aprendí mucho sobre su proyecto y fue muy interesante compartir nuestro lado como investigadoras cinco años despues de habernos graduado de escuela superior.

Por otro lado, quiero agradecer al programa BioMinds por la oportunidad de participar del mismo, y a todo el staff que nos ayudaron durante estos tres semestres. Para mi fue una experiencia muy enriquecedora, que me permitió crecer como profesional y como persona. Además estoy muy agradecida con mi mentor (Dr. Michael Rubin) por permitirme trabajar junto a él y sacar de su tiempo para ayudarme a realizar el proyecto. Gracias!!!!!